Выбор объективов для микроскопа – Часть 2

1. Каков размер изучаемых образцов (какое требуется увеличение)?

Эта статья — вторая из цикла «Выбор объективов для микроскопа». Ссылка на первую часть.

Увеличение является первейшим параметром при поиске наиболее оптимального объектива. На каждом объективе оно обозначается числом и буквой «х» (краты). Обычно производство объективов ограничивается увеличением в диапазоне от 4х до 100х (хотя также встречаются 1.25х и 250х). При этом конечное изображение дополнительно масштабируется посредством окуляров. Поэтому для того, чтобы получить общее оптическое увеличение, необходимо это увеличение умножить на увеличение окуляров (на рис. 2 схематически представлен процесс увеличения объекта).

Если нужно детально рассмотреть живые клетки и выполнить ручной подсчёт, то чаще всего используется объектив кратностью 40х и больше (400 крат общее увеличение с окулярами 10х); если же целью является пайка под стереомикроскопом, то дополнительно помимо базы (40х) обычно наоборот используется уменьшающий объектив кратностью 0.3х (то есть 12х общее).

2. Выбор объективов для микроскопа. Какого минимального размера будут детали наблюдаемого объекта

Второй ключевой параметр объектива — числовая апертура (ЧА), отражающая его способность собирать свет. Значение ЧА зачастую даже превосходит по важности увеличение, поскольку оно определяет разрешение, глубину фокуса, а также яркость изображения. Чем выше значение числовой апертуры, тем больше света может захватить объектив, что приводит к более яркому изображению и более высокому разрешению.

Яркость изображения прямо пропорциональна квадрату ЧА, но обратно пропорциональна квадрату увеличения. При этом характеристики (увеличение и ЧА) объектива, как правило, возрастают синхронно при производстве. Это значит, что даже при высокой апертуре может не случиться значительного выигрыша в яркости по причине компенсации из-за большого увеличения (хотя разрешение изображения при этом возрастёт).

Поэтому большая числовая апертура оказывает значительное влияние на наблюдение мельчайших структур или же при детектировании очень слабых флуоресцентных сигналов. Следовательно, когда возникает вопрос «Насколько малые объекты возможно будет различить в образце?», нужно первым делом принять во внимание числовую апертуру (она варьируется в пределах от 0.04 до 1.7). Поскольку чем больше ЧА, тем более мелкие объекты можно различить между собой (см. рис. 3).

3. Какие предъявляются требования к полю зрения и глубине резкости изображения?

Диаметр поля зрения (или просто поле зрения) — размер поля, видимого в окуляре микроскопа. Выражается в миллиметрах и измеряется в промежуточной плоскости изображения. У большинства современных микроскопов это значение варьируется от 18 (самые базовые, простейшие) до 26.5 мм (может быть и больше при использовании широкопольных окуляров).

Глубина резкости объектива — это его осевая (то есть вдоль оптической оси Z) характеристика, определяющая расстояние между плоскостями, в пределах которых изображение строится одинаково резким (также называется оптическим срезом). Всё, что за пределами — находится вне фокуса, и для отображения таких объектов резкими нужна перефокусировка. Стоит учитывать, что при больших значениях ЧА глубина резкости наименьшая. Поэтому для существенной смены резкости вдоль всей толщины образца нужно изменять фокусировку в гораздо большей степени, чем при малой ЧА, поскольку оптический срез (в который фокусируется объектив) тоньше.

4. Какое необходимо разрешение изображения?

Разрешение объектива определяется минимальным расстоянием между двумя точками образца, на котором их ещё можно различить (см. рис. 4). Разрешающая способность прямо пропорциональна длине волны освещения и обратно пропорциональна числовой апертуре. То есть чем выше значение ЧА, тем больше света собирает объектив, и тем меньшее расстояние между двумя точками можно различить. Поэтому важно исходить из требований Ваших задач. Задайте себе вопрос: какие минимальные структуры или детали нужно различать с помощью объектива?

Продолжение — Выбор объективов для микроскопа — Часть 3.

Даниил Гожальский, технический специалист, MSc in Nanotechnology